【摘要 】 目的 觀察人骨髓基質(zhì)細(xì)胞 (BMSCs)移植對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷 (H I BD)的保護(hù)作

用 ,探討 BMSCs腦移植** H I BD的可行性。方法 36只新生大鼠隨機(jī)分為對照組、 H I BD組和移植組

(均 n = 12)。H I BD組和移植組大鼠 7日齡時(shí)結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈后吸入 8% 氧氣 2 h制成 H I BD模型。對

照組僅分離左頸總動(dòng)脈 ,不予結(jié)扎和缺氧。分離培養(yǎng)人 BMSCs,損傷后 3 d將 BMSCs立體定位腦移植到移

植組大鼠左側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)皮層。3～4周齡時(shí) ,觀察大鼠行為學(xué)和組織學(xué)的改變 ,并用**熒光檢測移植細(xì)胞

的存活情況。結(jié)果 缺氧缺血后 3周 , H I BD組海馬 DG區(qū)和皮層單位面積內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目較正常組減少 [海

馬 DG區(qū): (39 . 2 ± 5 . 6) 個(gè) vs (51 . 1 ± 3 . 9)個(gè) , P < 0 . 001;皮層: (12 . 3 ± 3 . 0)個(gè) vs (17 . 8 ± 3 . 0)個(gè) , P <

0 . 001 ]。BMSCs移植后海馬 DG區(qū)和皮層單位面積內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目 [海馬: ( 44 . 9 ±3 . 1)個(gè) ,皮層: ( 17 . 5 ±

3 . 1)個(gè) ]較 H I BD組增加 ( P < 0 . 01)。與對照組比較 , H I BD組在 T迷宮、 感覺運(yùn)動(dòng)功能測試中表現(xiàn)出明顯

的不足。BMSCs腦移植組各項(xiàng)行為學(xué)測試成績較 H I BD組均有明顯改善。**熒光顯示移植后 3周 ,BM2

SCs在腦內(nèi)存活。結(jié)論 BMSCs腦移植可以改善新生鼠 H I BD。

盡管圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)取得了很大進(jìn)展 ,缺氧缺血性腦病

(H IE)的發(fā)病率并沒有明顯下降 ,它仍是腦癱、 精神發(fā)

育遲滯、 學(xué)習(xí)障礙和癲癇的常見原因[ 1 ]

。雖然目前

H IE的機(jī)制研究取得了很大進(jìn)展 ,但是臨床仍缺少特

異性**手段 ,以對癥支持綜合**為主。近來發(fā)現(xiàn)

骨髓基質(zhì)細(xì)胞 (BMSCs)移植可以**成年鼠大腦中

動(dòng)脈阻斷 (MCAO)模型缺血性腦損傷 , 但 BMSCs移植

**新生鼠缺氧缺血性腦損傷 (H I BD)是否也有效尚

缺乏相關(guān)的研究。新生動(dòng)物 H I BD屬于彌漫性腦損

傷 ,與成年大鼠 MCAO模型易損部位以及發(fā)病和修復(fù)機(jī)制均有不同。因此我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)探討BMSCs

移植對新生大鼠 H I BD有無保護(hù)作用。

材料與方法

一、 人 BMSCs的原代培養(yǎng)及傳代

取健康胸外傷病人肋骨 (由胸外科提供 ) ,無菌狀

態(tài)下 ,用 DMEM完全培養(yǎng)基仔細(xì)沖洗骨髓腔 ,將沖洗

下的組織反復(fù)通過 1ml的注射器 ,制備成細(xì)胞懸液 ,

鏡下計(jì)數(shù) ,稀釋后以 1 ×10

7

接種于 75 cm2

培養(yǎng)瓶中。

24 h后換液 ,去除未貼壁的細(xì)胞。待貼壁細(xì)胞 90%融

合后 , 0 . 25%胰蛋白酶消化傳代。

二、 動(dòng)物分組及缺氧缺血腦損傷模型的制備

36只新生清潔級 Sp rague2 Dawley大鼠 (由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 ) ,雌雄不拘 ,體質(zhì)量在 12 g以

上 ,隨機(jī)分為對照組 , H I BD組和 BMSCs移植組 ,每組

12只。按照 Rice方法[ 4 ]

制作 H I BD模型。簡述為:分

離、 結(jié)扎、 并剪斷左頸總動(dòng)脈 ,而后將之放入 8%的氮

氧混合氣的 36℃ 恒溫箱 2 h。12只對照組大鼠于 7日

齡行假手術(shù) ,僅予以分離左頸總動(dòng)脈 ,不予結(jié)扎和缺

氧。移植組大鼠在缺氧缺血后 3 d進(jìn)行移植。

三、 間接**熒光

正常山羊血清室溫封閉 30min;加入一抗 4℃冰

箱過夜; PBS洗 5min × 3次;加入二抗室溫 1 h; PBS洗

5min × 3次;熒光顯微鏡下觀察。BMSCs的鑒定所用

一抗分別為小鼠抗 CD11b單抗 (1: 200, Santa Cruz) ;

小鼠抗 CD90 . 1單抗 ( 1: 200, Chemicon) ;兔抗 CD34

多抗 ( 1: 200, Santa Cruz) ;兔抗 CD59多抗 ( 1: 200,

Santa Cruz) ;小鼠抗纖粘連蛋白單抗 ( 1: 200, Santa

Cruz)。體內(nèi)外人 BMSCs的識別所用一抗為小鼠抗人

核單抗 (1: 30, MAB1281, Chemicon)。二抗為山羊抗

小鼠 I gG2 Cy3 (1: 100, Sigma) ,或山羊抗兔 I gG2 Cy3 (1:

100, Sigma)。

四、 BMSCs移植

取第 5代 BMSCs,洗滌離心后 ,調(diào)整活細(xì)胞密度為

5 × 10

7

/ ml。應(yīng)用立體定位儀 ( ST OELTI NG T L 2型 ,

美國 ) ,以左側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)皮層區(qū) (前囟前 0 . 3mm;前囟

左 2mm,深 1 . 5mm)為移植點(diǎn) ,注入 2μl BMSCs細(xì)胞

懸液 (5 × 10

4

/μl)。

五、 行為學(xué)測試[ 2 ]

1 . T迷宮測試[ 2 ]

( T maze test) :每只動(dòng)物每日測

試 5次 ,每次間隔 15min,連續(xù) 4 d,共 20次。

2 .感覺運(yùn)動(dòng)功能測試: 34日齡時(shí)進(jìn)行測試[ 3 ]

。包

括足錯(cuò)誤 ,肢體放置和試驗(yàn)具體方法見鐘樂[ 2 ]

和王

霞[ 3 ]

報(bào)道。

六、 組織切片制備

28日齡時(shí)進(jìn)行。10%水合氯醛麻醉 ,打開胸腔 ,

左心室穿刺 ,注入冷**生理鹽水 ,同時(shí)剪開右心耳讓

血流出 ,直至流出的液體變清為止 ,再與以 4%多聚甲

醛 /0 . 1MPBS灌注固定。斷頭取腦 ,置于 4%多聚甲

醛 /0 . 1MPBS溶液中固定 72 h以上。常規(guī)脫水及石蠟

包埋 ,切片厚 3μm。

七、 尼氏染色

取前囟和前囟后 3mm部位切片 , 0 . 1%甲苯胺蘭

60℃ 溫染 1min,水洗 , 70%、 80%酒精脫水 , 95%酒精

鏡下分化 ,直至細(xì)胞核和背景為淡藍(lán)或無色, 100%酒

精脫水 ,松節(jié)油透明 ,封片。光鏡下 ( × 200)計(jì)數(shù)皮層

和海馬 DG區(qū)單位面積神經(jīng)元數(shù)目。

八、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部資料用 SPSS11 . 0軟件包統(tǒng)計(jì)軟件處理。

結(jié) 果

一、 BMSCs的原代培養(yǎng)與傳代剛接種時(shí) ,培養(yǎng)瓶中有大量的懸浮細(xì)胞。24 h換

液后可見部分細(xì)胞貼壁 ,仍為圓形。骨髓中的造血干

細(xì)胞不會(huì)貼壁 ,可在換液中逐漸除去。貼壁的細(xì)胞漸

增多 ,為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞 ,胞體細(xì)長呈纖維狀 ,細(xì)胞

核較大 ,為橢圓形。7 d時(shí) ,細(xì)胞呈簇狀生長 ,分布不

均 ,顯示出集落生長趨勢。至 2周時(shí) ,細(xì)胞融合成單

層。傳代細(xì)胞 24 h內(nèi)完全貼壁 , 3 d進(jìn)入對數(shù)生長期 ,

7～10 d后即可融合。

二、 **熒光

培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá) CD59, CD90 . 1和纖粘連蛋白等

抗原 ,不表達(dá) CD11b, CD34等白細(xì)胞和造血干細(xì)胞抗

原 ,說明其為 BMSCs。小鼠抗人核抗體 (MAB1281)能

識別來源于人的細(xì)胞核 ,不識別其他物種的細(xì)胞核 ,結(jié)

果顯示人 BMSCs表達(dá)人核抗體 ,而對照的大鼠 BMSCs不表達(dá)人核抗體。

三、 BMSCs移植對缺氧缺血后神經(jīng)元損傷的影響

缺氧缺血導(dǎo)致了神經(jīng)元損傷 ,使 H I BD組海馬 DG

區(qū)和皮層單位面積內(nèi)神經(jīng)元較正常組減少 [ ( 39 . 2 ±

5 . 6)個(gè) vs (51 . 1 ± 3 . 9)個(gè) , P < 0 . 001; (12 . 3 ± 3 . 0)個(gè)

vs (17 . 8 ±3 . 0)個(gè) , P < 0 . 001 ]。BMSCs移植后海馬

DG區(qū)和皮層單位面積內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目較 H I BD組增加

[ (44 . 9 ±3 . 1)個(gè) , P = 0 . 003; ( 17 . 5 ±3 . 1 )個(gè), P <

0 . 001 ]。

四、 BMSCs移植對缺氧缺血后行為學(xué)損傷的影響

1 . T迷宮測試:各組在連續(xù) 4 d的試驗(yàn)中 ,隨著天

數(shù)的增加 ,對照組和移植組正確率逐漸增高 ,而 H I BD

組正確率上升不明顯 ,說明學(xué)習(xí)能力較差。在第 4天

時(shí)各組間正確率的差異有顯著性意義 ( F = 24 . 772, P

< 0 . 001) , H I BD組的正確率較對照組和移植組顯著降

低 ( P < 0 . 001, P = 0 . 004) ,移植組的正確率低于對照

組 ( P = 0 . 007)。見表 1。

表 1 各組 T迷宮測試正確率 ( n = 12, % , x ±s )

組別 1 d 2 d 3 d 4 d

對照組 61 . 7 ± 18 . 0 81 . 7 ± 13 . 4 86 . 7 ± 15 . 6 98 . 3 ± 5 . 7

H I BD組 58 . 3 ± 27 . 8 63 . 3 ± 36 . 0 68 . 3 ± 26 . 2 66 . 7 ± 15 . 63 3

移植組 60 . 0 ± 19 . 1 70 . 0 ± 18 . 1 73 . 3 ± 21 . 5 86 . 7 ± 17 . 13 △

F值 0 . 077 1 . 719 2 . 325 24 . 772

P值 0 . 930 0 . 190 0 . 110 0 . 000

注:與對照組比較 3

P› 0. 05,

3 3

P› 0. 01;與 H I BD組比較 △ P›

0. 01

2 .感覺運(yùn)動(dòng)測試:足錯(cuò)誤:各組的足錯(cuò)誤右左差值

差異有顯著意義 ( F = 15 . 675, P < 0 . 001) , H I BD組右

左差值 (3 . 00 ± 1 . 04)較對照組 (0 . 67 ± 1 . 30)和移植

組 (0 . 33 ± 1 . 44)高 (均 P < 0 . 001) ,說明該組大鼠左

右運(yùn)動(dòng)不對稱 ,右側(cè)差于左側(cè)。移植組與對照組比較

差異沒有顯著意義 ( P = 0 . 525)。

姿勢反射:各組大鼠得分情況見表 2。對照組均

為 0分 ,而 H I BD組僅 8例為 0分 ,兩組差異有顯著意

義 ( Z = - 2 . 145, P = 0 . 032) ;移植組 11例為 0分 ,較表 2 各組大鼠姿勢反射不同得分情況比較 (例數(shù) )

組別 鼠數(shù) 0分 1分 2分

對照組 12 12 0 0

H I BD組3

12 8 4 0

移植組 12 11 1 0

注:與對照組比較,

3

P› 0. 05

H I BD組增多 ,但兩組間差異無顯著性 ( Z = - 1 . 476,

P = 0 . 140)。

肢體放置:對照組與移植組大鼠的得分差值絕大

多數(shù)為 0分 (百分率分別為 91 . 67%和 100% ) ,而

H I BD組的得分差為 1～4分 (1～4分得分百分率分別為 16 . 67%、 33 . 33%、 16 . 67%、 33 . 33% ) ,與對照組和

移植組比較差異有顯著性 ( Z = - 4 . 349, P < 0 . 001; Z

= - 4 . 4, P < 0 . 001)。

五、 移植后 BMSCs的檢測

單克隆抗人核抗體 (MAB1281)能識別移植到大

鼠腦內(nèi)的人 BMSCs。在移植部位可見大量陽性細(xì)胞

延針道分布 ,大量分布于移植點(diǎn)周圍 ,向腦實(shí)質(zhì)內(nèi)擴(kuò)

散 ,隨著移植點(diǎn)距離的增大陽性細(xì)胞逐漸減少