【摘要 】 目的 采用 HSF1基因敲除小鼠模型探討熱休克因子 1及熱休克蛋白 ( heat shock p r otein,
HSP)在慢性心理應(yīng)激中對工作記憶的保護(hù)作用。方法 將熱休克因子 1 ( heat shock fact or 1)基因野生型
小鼠 (HSF1 + / + )和熱休克因子 1基因敲除小鼠 (HSF12/2 )暴露于 2個月的慢性心理應(yīng)激 ,部分小鼠在暴
露于心理應(yīng)激前給予熱休克預(yù)處理 , 2個月后采用 T迷宮檢測各組小鼠工作記憶 ,western bl ots檢測和比較
HSP72, HSP25表達(dá) ,采用單因素方差分析和多因素析因設(shè)計方差分析對各組小鼠 T迷宮轉(zhuǎn)換正確數(shù)和
HSP72, HSP25表達(dá)進(jìn)行比較。結(jié)果 HSF1基因野生型小鼠中 ,慢性心理應(yīng)激對 T迷宮轉(zhuǎn)換正確數(shù) (8 . 90
± 0 . 46)次與對照組 (9 . 58 ± 0 . 48)次沒有明顯影響 ( F (1, 65) = 0 . 23, P > 0 . 05) , HSF1基因敲除小鼠中 ,慢
性心理應(yīng)激引起 T迷宮轉(zhuǎn)換正確數(shù) (4 . 00 ± 0 . 26)次明顯低于對照組 (7 . 33 ± 0 . 43)次 , F (1, 65) = 32 . 39, P <
0 . 05)。同時野生型小鼠心理應(yīng)激后海馬組織中 HSP72表達(dá) (1 . 35 ± 0 . 11) , HSP25表達(dá) (1 . 05 ± 0 . 03)明顯
高于 HSF1基因敲除小鼠 ( 0 . 23 ±0 . 03 ) , ( 0 . 26 ±0 . 02 ) ,均 P < 0 . 05 )。熱應(yīng)激也誘導(dǎo) HSP72 ( 1 . 71
± 0 . 05) , HSP25 (1 . 33 ± 0 . 05)表達(dá)增加 ,明顯高于 HSF1基因敲除小鼠 [ (0 . 26 ± 0 . 03) , (0 . 23 ± 0 . 08) ,均
P < 0 . 05 ] ,但未發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激預(yù)處理對 T迷宮轉(zhuǎn)換正確數(shù)有影響 ( F (1, 65) = 0 . 32, P > 0 . 05)。結(jié)論 HSF1以
及慢性心理應(yīng)激誘導(dǎo)的 HSP72, HSP25表達(dá) ,在慢性心理應(yīng)激中對工作記憶具有保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞 】 工作記憶; 熱休克蛋白; 熱休克因子 1; 慢性心理應(yīng)激; T迷宮
長時記憶與工作記憶都與海馬有關(guān)。慢性社會心
應(yīng)激可以損傷海馬 ,引起海馬依賴的長時記憶功能
害[ 1 ]
,但不影響工作記憶[ 2 ]
。急性應(yīng)激及輕度應(yīng)激
以引起工作記憶損害[ 3, 4 ]
,其機(jī)制與交感神經(jīng)的激
有關(guān)[ 5 ]
。而慢性社會心理應(yīng)激不引起工作記憶損害 ,其原因目前尚不清楚。熱休克反應(yīng)和慢性心理應(yīng)
激都可以激活 HSF1 ( heat shock fact or1, HSF1) ,誘導(dǎo)
熱休克蛋白 ( heat shock p rotein, HSP)表達(dá)增加 ,包括
HSP72、 HSP25,他們在應(yīng)激中具有重要的抗應(yīng)激、 保護(hù)
細(xì)胞、 維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能的作用。而 HSP表達(dá)
對心理應(yīng)激鼠工作記憶是否具有保護(hù)意義目前尚不清
楚。因此 ,本研究采用 HSF1野生型小鼠和 HSF1基因
敲除小鼠 ,給予慢性心理應(yīng)激及熱休克預(yù)處理 , T迷宮
評定各組小鼠工作記憶 , western bl ots檢測 HSP72、導(dǎo)的 HSP表達(dá)在心理應(yīng)激過程中對工作記憶是否具
有保護(hù)作用。
材料與方法
一、 動物與分組
本實驗動物來自美國德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)實驗
中心培育的 HSF1基因敲除雜合子進(jìn)行繁殖得來的野
生型小鼠 (基因型為: HSF1 + / + ,簡稱 HSF1 + / +小
鼠 )和 HSF1基因敲除的純合子 (基因型為: HSF12/2 ,
簡稱 HSF12/2 小鼠 ) ,在中南大學(xué)湘雅二院動物實驗中
心飼養(yǎng)。全價營養(yǎng)飼料 ,光照 8AM～8PM,室溫 (24 ±
0 . 5) ℃。
6～7月齡小鼠經(jīng)行為觀察剔除行為表現(xiàn)極端的
小鼠后 ,共選取 65只進(jìn)入實驗 ,其中 HSF1 + / +小鼠
共 37只 ,隨機(jī)分為 4組:對照組 (NS組 ) 12只 ,不給予
實驗應(yīng)激;心理應(yīng)激組 ( PS組 ) 10只 ,給予心理應(yīng)激;
熱休克預(yù)處理組 (HS組 ) 6只 ,給予熱休克預(yù)處理;熱
休克預(yù)處理加心理應(yīng)激組 (HS + PS組 ) 9只 ,給予熱休
克預(yù)處理和心理應(yīng)激。HSF12/2 小鼠共 28只 ,同樣分
為 NS組 12只 , HS組 6只 , PS組 5只, HS + PS組 5
只 ,分別接受與相對應(yīng)的 HSF1 + / +小鼠各組同樣的
處理。實驗過程中死亡的小鼠未記在內(nèi)。
二、 動物模型制備
1 . 熱休克預(yù)處理[ 6 ]
:采用自制的加熱裝置加熱 ,
使小鼠肛溫達(dá) (40 ± 1) ℃,維持約 15min。熱休克預(yù)處
理每周 2次 ,于周一和周四給予。
2 . 心理應(yīng)激:心理應(yīng)激包括限制應(yīng)激,高臺應(yīng)激
和旁觀電擊應(yīng)激。①限制應(yīng)激[ 7 ]
:將小鼠置于自制的
不透明塑料小瓶中 (直徑 4 cm,長 8 cm) ,使其無法在
里面自由活動。限制應(yīng)激每周 2次 ,每次 1 h。②高臺
應(yīng)激[ 8 ]
:把實驗小鼠放置在一個 10 cm × 10 cm,高1 . 6m
的平臺上 ,平臺放置在光線良好的房間的中央。高臺
應(yīng)激每周 2次 ,每次 1 h。③旁觀電擊應(yīng)激:旁觀電擊
應(yīng)激參照鄒濤等[ 9 ]
的方案進(jìn)行 ,旁觀電擊每周 2次 ,每
次 1 h,電擊每次持續(xù) 5 s,頻率為 1次 /min。
三、 工作記憶評定
根據(jù)文獻(xiàn)自制的 T型迷宮[ 10 ]
由兩條等長通道
(75 cm × 12 cm × 20 cm)組成 ,其中豎直部分的末端用
不透明活動門隔出 24cm的通道作為實驗動物的起始
位置。而兩臂的兩端分別作為兩個目標(biāo)位置 ,在兩臂
的入口分別有兩扇不透明活動門 ,可以對活動門進(jìn)行
開關(guān)操作。在迷宮周圍有明顯的視覺參考物。實驗開
始時將實驗小鼠放置在起始位置處 ,打開起始位置的
活動門 ,關(guān)上其中一臂入口處的活動門。由于小鼠的
探索天性 ,小鼠會進(jìn)入迷宮另一臂 ,實驗小鼠探索完回
到起始位置后 ,關(guān)上起始位置的活動門 ,讓實驗小鼠在
起始位置內(nèi)待 5 s,而后把三扇活動門全部打開 ,這時
實驗小鼠能選擇兩臂中的任意一段進(jìn)行探索 ,當(dāng)實驗
小鼠進(jìn)入其中一臂后 ,關(guān)上另一臂的活動門。當(dāng)實驗
動物從目標(biāo)區(qū)域回到起始區(qū)域后 ,關(guān)上起始區(qū)域的活
動門 ,讓動物在起始區(qū)域中待 5 s。以后重復(fù)**個步
驟 14次。記錄動物每次探索和前一次不同臂的比例 ,
即為 T迷宮正確轉(zhuǎn)換數(shù)。
四、 組織收集
各組動物經(jīng)在 2個月相應(yīng)處理 ,行為觀察 12 h后
斷頭處死 ,迅速于冰上剝出海馬 ,液氮中凍存?zhèn)溆谩?br>五、 提取蛋白和 western2 bl ots
取出凍存海馬 ,液氮中研磨成粉,裂解液裂解提取
海馬總蛋白 ,紫外分光光度法定量 ,上樣 ,經(jīng) 10% SDS 2
聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì) ,轉(zhuǎn)膜 ,封閉 ,一抗
( anti2 HSP72, anti2 HSP25, stressgen ) 4℃靜置孵育過
夜 ,二抗室溫?fù)u床搖 1 h, DAB顯色 ,全自動圖像分析
系統(tǒng)進(jìn)行光密度指數(shù)分析 , HSP含量以同一張膜上的
HSP含量與 GAPDH含量的比值來表示。
六、 數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)采用 SPSS12 . 0統(tǒng)計軟件 ,數(shù)據(jù)采用均數(shù) ±
標(biāo)誤表示 ,多組比較采用單因素方差分析和多因素析
因設(shè)計方差分析 ,兩兩比較采用 t檢驗。結(jié) 果
一、 工作記憶功能評定
HSF1基因、 熱休克預(yù)處理、 心理應(yīng)激對小鼠在 T
迷宮轉(zhuǎn)換正確數(shù)的影響見表 1。單因素方差分析結(jié)果
顯示:不同基因型、 不同處理組之間 T迷宮轉(zhuǎn)換正確
數(shù)之間有顯著性差異 ( F = 17 . 429, P = 0 . 000)。進(jìn)一
步做三因素 (HSF1基因、 熱休克預(yù)處理、 心理應(yīng)激 )析
因設(shè)計的方差分析 ,結(jié)果顯示:對 T迷宮轉(zhuǎn)換正確數(shù)
的影響 , HSF1基因具有主效應(yīng) ( F 1, 65 = 64 . 47, P =
0 . 00) ,心理應(yīng)激具有主效應(yīng) ( F 1, 65 = 17 . 61, P =
0 . 00) ,而熱應(yīng)激沒有主效應(yīng) ( F 1, 65 = 0 . 32, P =
0 . 57) , HSF1基因與心理應(yīng)激具有一階交互作用
( F 1, 65 = 14 . 62, P = 0 . 00)。對 HSF1基因與心理應(yīng)
激的一階交互作用做簡單效應(yīng)分析 ,發(fā)現(xiàn)在 HSF1 - /
小鼠中 心理應(yīng)激可以引起 迷宮轉(zhuǎn)換正確數(shù)明顯減少 ( F 1, 65 = 32 . 39, P = 0 . 00) ,而在 HSF1 + / +小
鼠中心理應(yīng)激沒有引起 T迷宮轉(zhuǎn)換正確數(shù)明顯減少
( F 1, 65 = 0 . 23, P = 0 . 64)。見表 1。
表 1 T迷宮轉(zhuǎn)換正確數(shù) (次 , x ±s )
組別 NS PS HS HS + PS
HSF1 + / + 9 . 58 ± 0 . 48
( n = 12)
8 . 90 ± 0 . 46
( n = 10)
9 . 17 ± 0 . 79
( n = 6)
9 . 56 ± 0 . 63
( n = 9)
HSF12/2 7 . 33 ± 0 . 43
( n = 12)
4 . 00 ± 0 . 263
( n = 6)
6 . 60 ± 0 . 40
( n = 5)
3 . 60 ± 0 . 243
( n = 5)
注:與 NS組, HS組比較,
3
P < 0. 05
二、 熱休克蛋白表達(dá)
1 . HSP72表達(dá):Western印跡分析法檢測海馬內(nèi)
HSP72的表達(dá) (見圖 1) 。結(jié)果顯示 , HSF12/2 各組小
鼠 HSP72表達(dá)顯著低于 HSF1 + / +各組小鼠。心理應(yīng)激引起 HSP72表達(dá)在 HSF1 + / +小鼠 ( 1 . 35 ±
0 . 11)中顯著高于 HSF12/2 小鼠 ( 0 . 23 ±0 . 03, P =
0 . 00)。同時 ,熱應(yīng)激預(yù)處理也誘導(dǎo) HSP72表達(dá)在
HSF1 + / +小鼠中 ( 1 . 71 ±0 . 05 )高于 HSF12/2 小鼠
(0 . 26 ± 0 . 03, P = 0 . 01)。
HSP25表達(dá) ,以探討熱休克預(yù)處理及慢性心理應(yīng)激誘