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神經(jīng)科**動物模型的制作經(jīng)驗方法交流
日期：2025-04-24 11:40
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摘要：
神經(jīng)科**動物模型的制作經(jīng)驗方法交流
大家在科研實驗中經(jīng)常涉及到動物模型的制作，望大家將這方面文獻以及經(jīng)驗進行交流。
腦缺血模型的制作：
制作腦缺血動物模型的方法很多，但常用方法主要有結(jié)扎法和栓塞法兩種，結(jié)扎法是運用外科手段結(jié)扎腦的供血動脈，中止腦的血氧供應(yīng)，它可以進一步分為顱內(nèi)結(jié)扎和顱外結(jié)扎。顱外結(jié)扎主要是用于制作全腦缺血模型，可進一步分為①4血管結(jié)扎，即結(jié)扎頸總動脈/頸內(nèi)動脈和椎動脈；②2血管結(jié)扎，即結(jié)扎兩側(cè)頸總/頸內(nèi)動脈，同時抽取動物一定量的血液，使血壓降低到50mmHg以下，達到造成全腦缺血的目的。這種方法因為需要監(jiān)視和控制血壓，實驗條件要求嚴(yán)格，且因椎動脈未予結(jié)扎，往往造成的腦缺血是不完全的。另一種兩血管結(jié)扎法是用沙土鼠（Gerbil）進行，利用沙土鼠腦底Willis動脈環(huán)發(fā)育不全后交通動脈缺如的特點，結(jié)扎兩側(cè)的頸總或頸內(nèi)動脈造成前腦缺血。栓塞法是用自體血凝塊、塑料或玻璃微球來栓塞實驗動物頸動脈、腦內(nèi)大動脈或微動脈，造成腦組織缺血模型，該法簡便易行，但可控性、可重復(fù)性差，且不能再灌流。
1. 實驗動物
實驗動物的選擇對腦缺血模型是非常重要的，理論上兔、貓、狗和靈長類都可被用來制作腦缺血模型，但更多的人傾向于選擇使用鼠作實驗。這主要是基于如下認(rèn)識：因為鼠是小動物，價格便宜，軀體小，消耗藥品試劑較少；鼠的腦血管解剖和生理與**動物無明顯差異；一些在體的實驗操作更容易進行，甚至在倫理學(xué)上更容易接受等等。
2. 儀器和設(shè)備
制作腦缺血動物模型的儀器設(shè)備分為二類：一類是為動物手術(shù)服務(wù)，包括一套手術(shù)器械，手術(shù)顯微鏡，顱鉆，腦立體定位儀，溫度控制裝置（控溫儀、紅外線燈和加熱墊），呼吸機；另一類是用于監(jiān)測和分析的儀器，包括腦電記錄裝置，血壓記錄裝置，多譜勒血流記錄儀，血氣血糖分析儀。
3. 四血管結(jié)扎腦缺血模型的制作
這是一個廣泛應(yīng)用的腦缺血模型。*常用的為Pulsinelli的改良方法。該模型選用Wistar大鼠，可以在清醒和自由運動狀態(tài)下制作嚴(yán)重的腦缺血和恒定的病理學(xué)改變。該模型分二個階段制作，**階段：將動物麻醉，按置在腦立體定位儀上，調(diào)節(jié)耳桿和門齒高度使鼠頭前傾約30度，同時用橡皮栓住鼠尾給以輕度的牽拉力，使頸椎伸直，翼孔呈水平位，便于觀察。枕骨下**頸椎水平正中切口，仔細(xì)分離兩側(cè)**頸椎橫突，暴露**頸椎橫突上的翼孔，翼孔下有兩則椎動脈通過，用小的單極或雙極電凝器插入翼孔燒灼閉塞雙側(cè)椎動脈。然后動物取背位，頸部正中切口，分離頸動脈鞘，注意不要損傷迷走神經(jīng)和頸動脈鞘后方的頸交感干。用外科縫線套住兩側(cè)頸總動脈（不要結(jié)扎），將線頭藏于皮下，簡單關(guān)閉切口；**階段：待動物麻醉清醒后自由飲水，但禁食12～24小時后，將動物于清醒狀態(tài)下，取背位，分別用繩子固定四肢和門齒，以控制動物掙扎。小心分離頸前部的切口，辯認(rèn)套在頸總動脈上的縫線，輕輕牽起，將線套收緊或者用微血管夾夾閉雙側(cè)頸總動脈。此時在2～3秒鐘內(nèi)大鼠將昏迷并喪失對光反射。缺血后2～3分鐘可出現(xiàn)異常腦電圖，并持續(xù)到缺血結(jié)束。頸總動脈的關(guān)閉時間根據(jù)實驗設(shè)計而定，通常取10～20分鐘。昏迷和反射消失是缺血是否成功的標(biāo)志。據(jù)統(tǒng)計約有四分之三的大鼠經(jīng)上述二階段處理可導(dǎo)致缺血成功。缺血期間自主呼吸和角膜反射的存在提示腦干血液供應(yīng)的存在，這是因為脊髓前動脈供血的原因。缺血結(jié)束后松開頸總動脈，動物通常很快清醒。但在24～72小時內(nèi)將有一部分動物出現(xiàn)缺血性抽搐，如果缺血持續(xù)30分鐘，在24小時內(nèi)將有20%、72小時有40%的鼠發(fā)生缺血性抽搐，這些發(fā)生抽搐的鼠在結(jié)果分析時應(yīng)被排除。
約有四分之一的鼠缺血不成功，其中2/3是昏迷不完全，另外1/3死于呼吸衰竭。該模型的制作的關(guān)鍵是燒灼椎動脈，由于椎動脈不能直接看到，這就需要操作者具有一定的經(jīng)驗，適當(dāng)?shù)恼莆諢频臅r間和電極與翼孔的角度，同時要避免損傷腦干。
4.大腦中動脈結(jié)扎模型的制作
結(jié)扎大腦中動脈（MCA）是制作局灶性腦缺血模型的常用方法，早期大多用較大的實驗動物（貓、狗）制作，近年來用大鼠制作的大腦中動脈結(jié)扎模型已被大家接受并得到廣泛的應(yīng)用。目前比較標(biāo)準(zhǔn)的模型是Tamura 1981年報道的方法[5]。他們于近側(cè)段結(jié)扎SD大鼠的大腦中動脈，并詳細(xì)比較了結(jié)扎后腦血流改變和組織病理學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)扎后4小時產(chǎn)生較為恒定的紋狀體和皮質(zhì)損害的腦血流（CBF）閾值是25ml/100g/min，這一閾值明顯較貓、猴要高。具體操作程序是：動物麻醉下，頭皮切口，分離顳肌，取外眥和外耳門連線的中點，用牙科鉆或環(huán)形顱鉆鉆開顱骨、暴露大腦中動脈，于手術(shù)顯微鏡下辯認(rèn)大腦中動脈及其分枝，在分枝的下方即MCA的近段，分離結(jié)扎或燒灼MCA，同時取頸部切口分離結(jié)扎同側(cè)的頸總動脈。在分離結(jié)扎或燒灼MCA時，應(yīng)避免損傷附近的腦組織，通常用鈍頭的直角鉤子固定于定位儀上，操縱定位儀旋鈕，輕輕地將MCA提起，然后燒灼或結(jié)扎。該模型操作的關(guān)鍵有兩點：(1)**的定位結(jié)扎部位，一定要在MCA的豆紋動脈分枝的下方，如果在其上方結(jié)扎將很少出現(xiàn)皮質(zhì)和基底節(jié)梗塞灶。但是在實驗操作時往往不能辯認(rèn)出MCA的分支，此時可以嗅溝為標(biāo)志，在其以下進行結(jié)扎；(2)同側(cè)頸總動脈的長久結(jié)扎，能夠加重MCA供血區(qū)的缺血程度，是恒定的腦梗塞出現(xiàn)的必要條件，有時甚至配以暫時的對側(cè)頸總動脈結(jié)扎。
該法的優(yōu)勢是病理生理變化接近人類的MCA栓塞，經(jīng)改進后也可進行重灌流研究。其缺點是開顱破壞了顱內(nèi)壓的恒定，擾亂了腦脊液循環(huán)的動力學(xué)，并易致**侵入，從而影響組織病理學(xué)評價。此外，附著在MCA上交感神經(jīng)纖維可因結(jié)扎或電凝而損傷，使血管的自調(diào)節(jié)功能受損。
5、腦缺血模型的測量指標(biāo)
用于腦制備評價的測量指標(biāo)很多，包括行為學(xué)、組織病理學(xué)、生物化學(xué)、生理學(xué)和分子生物學(xué)。具體地如何選擇評價指標(biāo)要根據(jù)實驗者的實驗設(shè)計，根據(jù)實驗設(shè)計者所要試驗的假說來決定。一般的指標(biāo)有死亡率、神經(jīng)病學(xué)缺失、行為學(xué)損害、組織病理學(xué)損害等等。1. 死亡率是一個比較簡便的指標(biāo)，在研究**療效時有一定的作用，但對于腦缺血操作機制的研究所提供的信息非常有限；2. 神經(jīng)病學(xué)缺失的記分方法：這是模擬人類卒中后的臨床癥狀進行評分，但在實際應(yīng)用中其指標(biāo)變異太大且客觀性不夠，應(yīng)用受到限制。例如大腦中動脈結(jié)扎后是否出現(xiàn)運動損害更多的是決定于缺血是否累及內(nèi)囊而與梗塞灶的大小關(guān)系不大。常用大腦中動脈結(jié)扎后的神經(jīng)缺失評價為5級記分法：無神經(jīng)缺失記為0級；對側(cè)前肢不能充分伸直，顯示輕度局灶性神經(jīng)病缺失記為1級；2級為中度局灶性神經(jīng)損害，動物向?qū)?cè)、旋轉(zhuǎn)；顯示嚴(yán)重的局灶性神經(jīng)損害為3級，動物倒向?qū)?cè)；4級損害是不能自發(fā)行走，并伴有不同程度的意識障礙；3. 復(fù)雜的行為學(xué)指標(biāo)對評價缺血損傷有一定的作用。如逃避反射的跳臺試驗、Y型迷宮和Morris水迷宮等，但這類指標(biāo)要求較高，需對研究人員和實驗動物進行專門的訓(xùn)練，花費時間較長。許多研究人員選擇更為客觀的測量指標(biāo)，如CBF、腦的糖代謝和組織病理學(xué)觀察。要注意的是這類指標(biāo)的腦區(qū)間的差異較大，需同時進行多參數(shù)分析。在上述指標(biāo)中評價缺血性損害的金標(biāo)準(zhǔn)（gold standard）是組織病理學(xué)觀察。例如大腦中動脈結(jié)扎后，用腦梗塞灶體積的大小、半影區(qū)的大小來評價缺血損害的程度。全腦缺血模型鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞丟失的數(shù)量，或者紋狀體內(nèi)神經(jīng)元死亡的數(shù)量來評價全腦一過性缺血損害的程度和某些**的**效果。
腦缺血模型的制作：
制作腦缺血動物模型的方法很多，但常用方法主要有結(jié)扎法和栓塞法兩種，結(jié)扎法是運用外科手段結(jié)扎腦的供血動脈，中止腦的血氧供應(yīng)，它可以進一步分為顱內(nèi)結(jié)扎和顱外結(jié)扎。顱外結(jié)扎主要是用于制作全腦缺血模型，可進一步分為①4血管結(jié)扎，即結(jié)扎頸總動脈/頸內(nèi)動脈和椎動脈；②2血管結(jié)扎，即結(jié)扎兩側(cè)頸總/頸內(nèi)動脈，同時抽取動物一定量的血液，使血壓降低到50mmHg以下，達到造成全腦缺血的目的。這種方法因為需要監(jiān)視和控制血壓，實驗條件要求嚴(yán)格，且因椎動脈未予結(jié)扎，往往造成的腦缺血是不完全的。另一種兩血管結(jié)扎法是用沙土鼠（Gerbil）進行，利用沙土鼠腦底Willis動脈環(huán)發(fā)育不全后交通動脈缺如的特點，結(jié)扎兩側(cè)的頸總或頸內(nèi)動脈造成前腦缺血。栓塞法是用自體血凝塊、塑料或玻璃微球來栓塞實驗動物頸動脈、腦內(nèi)大動脈或微動脈，造成腦組織缺血模型，該法簡便易行，但可控性、可重復(fù)性差，且不能再灌流。
1. 實驗動物
實驗動物的選擇對腦缺血模型是非常重要的，理論上兔、貓、狗和靈長類都可被用來制作腦缺血模型，但更多的人傾向于選擇使用鼠作實驗。這主要是基于如下認(rèn)識：因為鼠是小動物，價格便宜，軀體小，消耗藥品試劑較少；鼠的腦血管解剖和生理與**動物無明顯差異；一些在體的實驗操作更容易進行，甚至在倫理學(xué)上更容易接受等等。
2. 儀器和設(shè)備
制作腦缺血動物模型的儀器設(shè)備分為二類：一類是為動物手術(shù)服務(wù)，包括一套手術(shù)器械，手術(shù)顯微鏡，顱鉆，腦立體定位儀，溫度控制裝置（控溫儀、紅外線燈和加熱墊），呼吸機；另一類是用于監(jiān)測和分析的儀器，包括腦電記錄裝置，血壓記錄裝置，多譜勒血流記錄儀，血氣血糖分析儀。
3. 四血管結(jié)扎腦缺血模型的制作
這是一個廣泛應(yīng)用的腦缺血模型。*常用的為Pulsinelli的改良方法。該模型選用Wistar大鼠，可以在清醒和自由運動狀態(tài)下制作嚴(yán)重的腦缺血和恒定的病理學(xué)改變。該模型分二個階段制作，**階段：將動物麻醉，按置在腦立體定位儀上，調(diào)節(jié)耳桿和門齒高度使鼠頭前傾約30度，同時用橡皮栓住鼠尾給以輕度的牽拉力，使頸椎伸直，翼孔呈水平位，便于觀察。枕骨下**頸椎水平正中切口，仔細(xì)分離兩側(cè)**頸椎橫突，暴露**頸椎橫突上的翼孔，翼孔下有兩則椎動脈通過，用小的單極或雙極電凝器插入翼孔燒灼閉塞雙側(cè)椎動脈。然后動物取背位，頸部正中切口，分離頸動脈鞘，注意不要損傷迷走神經(jīng)和頸動脈鞘后方的頸交感干。用外科縫線套住兩側(cè)頸總動脈（不要結(jié)扎），將線頭藏于皮下，簡單關(guān)閉切口；**階段：待動物麻醉清醒后自由飲水，但禁食12～24小時后，將動物于清醒狀態(tài)下，取背位，分別用繩子固定四肢和門齒，以控制動物掙扎。小心分離頸前部的切口，辯認(rèn)套在頸總動脈上的縫線，輕輕牽起，將線套收緊或者用微血管夾夾閉雙側(cè)頸總動脈。此時在2～3秒鐘內(nèi)大鼠將昏迷并喪失對光反射。缺血后2～3分鐘可出現(xiàn)異常腦電圖，并持續(xù)到缺血結(jié)束。頸總動脈的關(guān)閉時間根據(jù)實驗設(shè)計而定，通常取10～20分鐘。昏迷和反射消失是缺血是否成功的標(biāo)志。據(jù)統(tǒng)計約有四分之三的大鼠經(jīng)上述二階段處理可導(dǎo)致缺血成功。缺血期間自主呼吸和角膜反射的存在提示腦干血液供應(yīng)的存在，這是因為脊髓前動脈供血的原因。缺血結(jié)束后松開頸總動脈，動物通常很快清醒。但在24～72小時內(nèi)將有一部分動物出現(xiàn)缺血性抽搐，如果缺血持續(xù)30分鐘，在24小時內(nèi)將有20%、72小時有40%的鼠發(fā)生缺血性抽搐，這些發(fā)生抽搐的鼠在結(jié)果分析時應(yīng)被排除。
約有四分之一的鼠缺血不成功，其中2/3是昏迷不完全，另外1/3死于呼吸衰竭。該模型的制作的關(guān)鍵是燒灼椎動脈，由于椎動脈不能直接看到，這就需要操作者具有一定的經(jīng)驗，適當(dāng)?shù)恼莆諢频臅r間和電極與翼孔的角度，同時要避免損傷腦干。
4.大腦中動脈結(jié)扎模型的制作
結(jié)扎大腦中動脈（MCA）是制作局灶性腦缺血模型的常用方法，早期大多用較大的實驗動物（貓、狗）制作，近年來用大鼠制作的大腦中動脈結(jié)扎模型已被大家接受并得到廣泛的應(yīng)用。目前比較標(biāo)準(zhǔn)的模型是Tamura 1981年報道的方法[5]。他們于近側(cè)段結(jié)扎SD大鼠的大腦中動脈，并詳細(xì)比較了結(jié)扎后腦血流改變和組織病理學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)扎后4小時產(chǎn)生較為恒定的紋狀體和皮質(zhì)損害的腦血流（CBF）閾值是25ml/100g/min，這一閾值明顯較貓、猴要高。具體操作程序是：動物麻醉下，頭皮切口，分離顳肌，取外眥和外耳門連線的中點，用牙科鉆或環(huán)形顱鉆鉆開顱骨、暴露大腦中動脈，于手術(shù)顯微鏡下辯認(rèn)大腦中動脈及其分枝，在分枝的下方即MCA的近段，分離結(jié)扎或燒灼MCA，同時取頸部切口分離結(jié)扎同側(cè)的頸總動脈。在分離結(jié)扎或燒灼MCA時，應(yīng)避免損傷附近的腦組織，通常用鈍頭的直角鉤子固定于定位儀上，操縱定位儀旋鈕，輕輕地將MCA提起，然后燒灼或結(jié)扎。該模型操作的關(guān)鍵有兩點：(1)**的定位結(jié)扎部位，一定要在MCA的豆紋動脈分枝的下方，如果在其上方結(jié)扎將很少出現(xiàn)皮質(zhì)和基底節(jié)梗塞灶。但是在實驗操作時往往不能辯認(rèn)出MCA的分支，此時可以嗅溝為標(biāo)志，在其以下進行結(jié)扎；(2)同側(cè)頸總動脈的長久結(jié)扎，能夠加重MCA供血區(qū)的缺血程度，是恒定的腦梗塞出現(xiàn)的必要條件，有時甚至配以暫時的對側(cè)頸總動脈結(jié)扎。
該法的優(yōu)勢是病理生理變化接近人類的MCA栓塞，經(jīng)改進后也可進行重灌流研究。其缺點是開顱破壞了顱內(nèi)壓的恒定，擾亂了腦脊液循環(huán)的動力學(xué)，并易致**侵入，從而影響組織病理學(xué)評價。此外，附著在MCA上交感神經(jīng)纖維可因結(jié)扎或電凝而損傷，使血管的自調(diào)節(jié)功能受損。
5、腦缺血模型的測量指標(biāo)
用于腦制備評價的測量指標(biāo)很多，包括行為學(xué)、組織病理學(xué)、生物化學(xué)、生理學(xué)和分子生物學(xué)。具體地如何選擇評價指標(biāo)要根據(jù)實驗者的實驗設(shè)計，根據(jù)實驗設(shè)計者所要試驗的假說來決定。一般的指標(biāo)有死亡率、神經(jīng)病學(xué)缺失、行為學(xué)損害、組織病理學(xué)損害等等。1. 死亡率是一個比較簡便的指標(biāo)，在研究**療效時有一定的作用，但對于腦缺血操作機制的研究所提供的信息非常有限；2. 神經(jīng)病學(xué)缺失的記分方法：這是模擬人類卒中后的臨床癥狀進行評分，但在實際應(yīng)用中其指標(biāo)變異太大且客觀性不夠，應(yīng)用受到限制。例如大腦中動脈結(jié)扎后是否出現(xiàn)運動損害更多的是決定于缺血是否累及內(nèi)囊而與梗塞灶的大小關(guān)系不大。常用大腦中動脈結(jié)扎后的神經(jīng)缺失評價為5級記分法：無神經(jīng)缺失記為0級；對側(cè)前肢不能充分伸直，顯示輕度局灶性神經(jīng)病缺失記為1級；2級為中度局灶性神經(jīng)損害，動物向?qū)?cè)、旋轉(zhuǎn)；顯示嚴(yán)重的局灶性神經(jīng)損害為3級，動物倒向?qū)?cè)；4級損害是不能自發(fā)行走，并伴有不同程度的意識障礙；3. 復(fù)雜的行為學(xué)指標(biāo)對評價缺血損傷有一定的作用。如逃避反射的跳臺試驗、Y型迷宮和Morris水迷宮等，但這類指標(biāo)要求較高，需對研究人員和實驗動物進行專門的訓(xùn)練，花費時間較長。許多研究人員選擇更為客觀的測量指標(biāo)，如CBF、腦的糖代謝和組織病理學(xué)觀察。要注意的是這類指標(biāo)的腦區(qū)間的差異較大，需同時進行多參數(shù)分析。在上述指標(biāo)中評價缺血性損害的金標(biāo)準(zhǔn)（gold standard）是組織病理學(xué)觀察。例如大腦中動脈結(jié)扎后，用腦梗塞灶體積的大小、半影區(qū)的大小來評價缺血損害的程度。全腦缺血模型鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞丟失的數(shù)量，或者紋狀體內(nèi)神經(jīng)元死亡的數(shù)量來評價全腦一過性缺血損害的程度和某些**的**效果。
